Фарма.РФ. Как отечественные компании создают лекарства будущего уже сегодня - Евгений Зеленский

американским ученым Брайаном Сауэром еще в далеком для такой инновационной темы 1987 году. В то время была использована так называемая Cre-Lox-опосредованная рекомбинация, в ходе которой удалось разрезать целевые участки ДНК с помощью специального фермента Cre-рекомбиназы. Но с ранними методами редактирования генома возникло много сложностей, они были очень дорогими и трудоемкими. А заодно, часто и недостаточно точными. Часть этих проблем удалось разрешить уже только в XXI веке.

Современные биотехнологи разрабатывают три основных системы редактирования генов. Первой и самой нашумевшей является технология CRISPR-Cas9. О ней мы скоро поговорим особенно подробно9,10.

Две другие технологии геномного редактирования — это так называемые «цинковые пальцы» и TALEN. Попробуем разобраться в самых общих чертах, что все это из себя представляет.

Цинковые пальцы или сокращенно ZNF (Zinc-finger nucleases — с английского «нуклеазы цинкового пальца») — технология, которая состоит из двух компонентов. Первый — синтетические белки заданной формы с ионом цинка, которые могут связываться с определённым коротким участком ДНК. А второй — нуклеаза, то есть фермент, способный расщеплять в этом выбранном месте ДНК. Вместе они работают как «геномные ножницы», разделяя нуклеотидную последовательность14,15.

TALEN (Transcription activator-like effector nuclease — с английского «эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции») работает по схожему принципу. TALE — специальный белок, полученный от растительных бактерий Xanthomonas. А буква «N» в этой аббревиатуре означает нуклеазу, тот самый разрезающий ДНК фермент.

И ZNF, и TALEN — методы, основанные на природных свойствах определенных нуклеаз. Эти ферменты умеют проводить специфическое вырезание участка генома и встраивание на место разреза фрагмента исправленной ДНК, привнесенного с собой. Такой способ позволяет проводить целевые и точечные изменения нарушенных генов, гораздо более точное, чем у предшествующих технологий.

Отличие ZFN и TALEN заключается в использовании разных видов ферментов, но сам общий итог их работы примерно одинаков.

К сожалению, ZFN и TALEN пока не нашли массового применения в медицине, прежде всего из-за значительной сложности этих методов. Для редактирования же генома с помощью системы CRISPR/Cas9 используется единственный белок Cas9. Технология основана на простом принципе комплементарного узнавания нуклеиновых кислот, а все необходимое можно создать за довольно короткое время. Это уровень редактирования, более дешевый и простой14,15.

Так что же такое CRISPR-Cas9? Давайте разбираться!

Долгое время считалось, что бактерии не имеют, в отличие от животных и человека, своей собственной иммунной защиты. В нашем организме за иммунитет отвечает множество клеток, организованных в чрезвычайно сложную молекулярную структуру. Однако, как выяснилось, и у бактерий есть своя, но гораздо более простая система молекулярного иммунитета, обеспечивающая бактериальной клетке защиту от внешних врагов — фагов и других патогенов.

Еще в 1989 г. японские исследователи обнаружили в геноме кишечной палочки участок, содержащий многочисленные повторы. Его назвали CRISPR-локусом (с английского «clustered regularly interspaced short palindromic repeats» — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами). Что собственно и дало название будущей технологии.

Их структура была идентична по нуклеотидным последовательностям, а вот у промежутков, или, как их теперь называют, спейсеров (от английского «spacer» — разделитель, вставка), она оказалась вариабельной и часто была гомологичной последовательностям, обнаруженным в геномах фагов и плазмид. По сути, такой участок — это генетическая память популяции бактерий о тех столкновениях с внешним врагом, в борьбе с которым бактериальной клетке удалось выжить и «законспектировать» встречу.

Иными словами, в этих промежутках (спейсерах) закладывается впрок на хранение информация о бактериофагах (вирусы, поражающие бактерий), которая используется бактериями в уникальной системе защиты от губительного воздействия патогенов. В состав этого адаптивного молекулярного иммунитета входят палиндромные повторы, спейсеры и гены специализированных нуклеаз Cas — ферментов, способных вырезать участки нуклеиновых кислот. Примерно аналогичных технологиям, которые мы обсуждали выше10.

Возникает вопрос: почему же нуклеаза помечена именно цифрой 9? Вообще-то, их в бактериальной клетке больше десяти, но наиболее подходящей для функционирования CRISPR-системы оказалась именно Cas9.

В 2012 г. появились первые публикации, описавшие применение технологии CRISPR Cas9 для редактирования генома эукариотов, то есть животных и человека. А в научном языке для его обозначения стали использовать термин «CRISPR-система». С тех пор число статей по этой теме стало расти огромными темпами9–12.

Как оказалось, компоненты CRISPR-системы можно адаптировать к другим геномам, к использованию на клетках человека, и там она будет работать по «навязанной» ей программе. При этом с высокой точностью отыщется любая нуклеотидная последовательность. Например, в геноме человека насчитывается более 3 миллиардов пар нуклеотидов, и на всей этой огромной протяженности возможно разрезать спираль ДНК в точном и конкретном месте, удалить или подправить «плохой», «сломанный» ген и вшить вместо него другой — «здоровый»13,17.

Совсем недавно, в 2020 году, за разработку этого блестящего метода в применении к клеткам человека ученые Дженнифер Даудна и Эммануэль Шарпантье удостоены Нобелевской премии по химии. Сначала на бактерии Streptococcus pyogenes (синегнойная палочка) они установили, как именно работает белок Cas9, а позднее смогли показать, что с помощью такого механизма можно разрезать в заданной точке любую молекулу ДНК, в том числе и ДНК человека17.

Конечно же, создание системы CRISPR-Cas немедленно явилось мощным стимулом ее использования и в нашей стране. Внедрение новой технологии произвело настоящую революцию в области генетической терапии, поскольку она позволяет намного более точно редактировать гены, чем ранее описанные инструменты, проверить ее на животных моделях и вплотную подступить к лечению генетических заболеваний у людей.

Уже показано, что метод CRISPR невероятно полезен при моделировании наследственных болезней, и в первую редких для человеческой популяции. Модели заболеваний, в развитие которых вовлечены множество генов, созданные с помощью CRISPR-системы, дают возможность определить, нокаут (выключение) каких именно генов приводит к тем или иным изменениям в клетках, как из клеток формируются разнообразные ткани с различным генетическим фоном и какие молекулярные события происходят при развитии того или иного патологического процесса. Такие данные позволяют существенно улучшить наше понимание о природе тех или иных заболеваний и, изучив механизмы, лучше подбирать методы терапии.

Еще одна громадная задача, решаемая посредством CRISPR Cas9, — разработка методов лечения вирусных инфекций, например, вируса иммунодефицита человека ВИЧ, после которого клетки становятся невосприимчивыми к ВИЧ, а также коррекция мутаций, обусловливающих различные наследственные заболевания — муковисцидоз, миодистрофию Дюшена, гемофилию, серповидноклеточную анемию и множество других заболеваний10,19,20.

Крупным прорывом в области генной терапии стало сообщение о том, что ученые-клиницисты сохранили жизнь девочке, родившейся с фатальным наследственным нейромышечным заболеванием — спинальной мышечной атрофией 1го типа. При этом страшном генетическом заболевании возникает нарастающая мышечная слабость и у пациента прогрессивно снижается способность мышц к сокращению. По мере прогрессирования болезни возникают непреодолимые нарушения дыхания